5. การเก็บรักษาน้ำเชื้อ

                                  บทที่ 5 การเก็บรักษาน้ำเชื้อ      
      
       เมื่อรีดน้ำเชื้อและตรวจคุณภาพน้ำเชื้อแล้ว จะเข้าสู่กระบวนการผลิตน้ำเชื้อทันที เนื่องจากหากเก็บไว้ที่อุณหภูมิห้องปกติไม่มีการเติมน้ำยาเจือจาง เซลล์อสุจิจะเสื่อมสภาพ มีการสร้างของเสียและสารต่างๆ ที่เป็นอันตรายต่อการดำรงชีวิตของเซลล์อสุจิ มีการสูญเสียพลังงาน ขณะเดียวกันผนังเซลล์และองค์ประกอบต่างๆ ภายในเซลล์อสุจิจะเสื่อมสภาพจนไม่สามารถปฏิสนธิได้ และตายในระยะเวลาอันสั้น ในปัจจุบันนิยมผลิตน้ำเชื้อแช่แข็งสำหรับใช้ในการผสมเทียม

การแช่แข็งและการเก็บรักษาน้ำเชื้อ      
     ก่อนทำการแช่แข็งน้ำเชื้อ จะทำการเจือจางด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อที่เหมาะสม ซึ่งประกอบด้วยองค์ประกอบที่สำคัญ คือ
1. สารละลาย โดยทั่วไปมักใช้ส่วนผสมนมหรือน้ำกลั่นเป็นสารละลาย บรรจุหลอดบรรจุน้ำเชื้อแช่แข็ง (plastic ministraws) ส่วนใหญ่ใช้หลอดบรรจุขนาด 0.25 มล. บางประเทศ เช่น แคนาดา สหรัฐอเมริกา ใช้หลอดบรรจุขนาด 0.5 มล. จำนวนอสุจิใน 1 หลอด จะกำหนดที่ 20 ล้านตัวต่อ 1 หลอด (ปัจจุบันลดลงที่ 8-12 ล้านตัวต่อหลอด) ดังนั้นการคำนวณการผสมสารละลายขึ้นกับความเข้มข้นของน้ำเชื้อในครั้งที่รีด เพื่อให้ได้จำนวนอสุจิตามกำหนดในหลอดบรรจุ
2. สารป้องกันอันตรายจากความเย็นและการแช่แข็ง ไข่แดง (egg yolk) มักถูกใช้ 10% ของปริมาณสารละลาย นม หรือใช้ไข่แดงผสมนมก็สามารถใช้ได้ จะช่วยป้องกันเซลล์อสุจิไม่ให้แตกและถูกทำลายจากผลึกน้ำแข็ง (ice crystals) ในระหว่างการแช่แข็ง นอกจากนี้ glycerol จะช่วยป้องกันอสุจิจากขบวนการแช่แข็งด้วย โดยใช้ประมาณ 7%
3. สารให้พลังงาน แหล่งพลังงานที่ดี คือ น้ำตาล เช่น fructose
4. สารปรับความเป็นกลาง จากขบวนการ metabolism ของอสุจิจะผลิตกรดแลคติก (lactic acid) ซึ่ง pH ต่ำอาจทำอันตรายอสุจิได้ การเติม citrate phosphate และ tris buffers จะช่วยปรับความเป็นกลางได้ การเติม tris มีข้อดีที่สามารถเติม glycerol ได้เลย โดยไม่ต้องรอเติมหลังการเริ่มทำให้เย็นลง
5. สารรักษา osmotic pressure น้ำตาลที่ผสมในสารละลายจะช่วยลดการเกิด hypoosmotic ป้องกันเซลล์อสุจิแตก
6. สารควบคุมและป้องกันเชื้อแบคทีเรีย การเติมยาปฏิชีวนะในสารละลายน้ำเชื้อจะช่วยควบคุมจำนวนแบคทีเรียจากการปนเปื้อนและเชื้อที่ติดทางการสืบพันธุ์ เช่น vibriosis นอกจากนี้สารละลายน้ำเชื้อต้องถูกเตรียมให้สด สะอาด ลดโอกาสปนเปื้อนให้มากที่สุด ยาปฏิชีวนะที่ใช้ เช่น penicillin 500 ยูนิต streptomycin 0.5 มก. Lincomycin 150 ไมโครกรัม spectinomycin 300 ไมโครกรัม ผสมในสูตรละลายน้ำเชื้อ
     ตัวอย่างสูตรอาหารเลี้ยงเชื้อในโค ประกอบด้วย
Tris 24.2 กรัม
Citric acid monohydrate 13.4 กรัม
Glucose หรือ Fructose 10.0 กรัม
Penicillin 1000 ยูนิต/มล.
Streptomycin 1000 ไมโครกรัม/มล.
Polymyxin B 500 ยูนิต/มล.

                      รูปภาพที่ 1 แสดงการเตรียมสารละลายก่อนการเจือจางน้ำเชื้อ
        ผสมส่วนประกอบทั้งหมดละลายในน้ำกลั่นจำนวนพอควรแล้วเติม glycerol 70 มล. เขย่าให้ละลายแล้วจึงเติมน้ำกลั่นเพื่อให้เป็นปริมาตรรวม 1000 มล. (ในวันจะใช้อาหารเลี้ยงเชื้อให้เติมไข่แดงที่สดคุณภาพดี จำนวน 200 มล. โดยปริมาตรรวมเป็น 1000 มล.) ในปัจจุบันมีอาหารเลี้ยงอสุจิหรือสารละลายน้ำเชื้อ (dilutor) สำเร็จรูป เมื่อจะใช้ให้นำมาละลายน้ำกลั่นและไข่แดงในสัดส่วนที่ระบุไว้ มีคุณสมบัติเป็นอาหารเลี้ยงน้ำเชื้อที่มีคุณภาพเป็นที่นิยมใช้ในห้องปฏิบัติการผลิตน้ำเชื้อแช่แข็งโค โดยมียาปฏิชีวนะให้เลือก 2 กลุ่ม กลุ่มหนึ่งเป็นยาปฏิชีวนะที่กำหนดให้ใช้ในประเทศสหรัฐอเมริกา คือ penicillin streptomycin lincomycin spectinomycin อีกกลุ่มหนึ่งเป็นยาปฏิชีวนะที่ระบุให้ใช้ในประเทศยุโรป คือ tylosin gentamicin lincomycin spectinomycin
        ขบวนการแช่แข็งโดยทั่วไปจะทำให้น้ำเชื้ออสุจิที่ผสมสารละลายหรือเรียกว่า “อาหารเลี้ยงเชื้อ” แล้วบรรจุลงหลอดน้ำเชื้อขนาดที่นิยมใช้ คือ 0.25 มล. ที่มีการประทับชื่อ รหัสพ่อพันธุ์ สถานีผลิตน้ำเชื้อ วันที่และปีที่ผลิต แล้วทำให้เย็นลงที่ 5 องศาเซลเซียส เพื่อเกิดความสมดุลระหว่างตัวอสุจิกับสารละลาย 2-4 ชม. ก่อนนำลงไปที่ความเย็นอุณหภูมิ -110 - -130 องศาเซลเซียส ในเวลาควบคุมประมาณ 10 นาที แล้วจุ่มลงใต้ระดับไนโตรเจนเหลวที่ -196 องศาเซลเซียส แล้วจัดเก็บในช่องเก็บในถังคลังน้ำเชื้อ (semen bank) อย่างมีระบบจัดเก็บทีดี สามารถค้นหา และเลือกใช้พ่อพันธุ์ที่ต้องการได้ง่ายและไว

กระบวนการในการผลิตน้ำเชื้อแช่แข็ง

1. การเตรียมสารละลายน้ำเชื้อ (buffer and diluters preparation)    จะต้องเตรียมสารละลายพวก sodium citrate และสารเคมีอื่นๆ ที่ไม่เสียไว้ล่วงหน้าก่อน และเก็บไว้ในตู้เย็นก็ได้ โดยการเตรียมเป็นจำนวนมาก ส่วนมากเตรียมในขวดแก้วโดยชั่งสารที่ต้องการแล้วเติมน้ำกลั่นลงไป ให้ถูกต้องตามสูตร ผสมโดยใช้ electrical stirrer ถ้าไม่มีก็ใช้วิธีเขย่าก็ได้ สำหรับสารที่อาจเสียได้ง่าย เช่น glucose, glycine และ ไข่แดง ควรเตรียมขึ้นใหม่ก่อนใช้ วิธีเตรียมไข่แดง เช็ดเปลือกไข่รอบนอกให้สะอาดฆ่าเชื้อด้วยแอลกอฮอล์ 70% ทิ้งให้แห้ง ต่อยให้แตกปล่อยให้ไข่ขาวไหลออกมาให้มากที่สุด หลังจากนั้นให้ไข่แดงพลิกไปมาบนกระดาษกรองวิทยาศาสตร์ เพื่อให้ไข่ขาวที่ติดออกให้หมด แล้วจึงบีบให้แตกในกระดาษกรองอีกอันหนึ่ง ปล่อยให้ไหลลงใน cylinder เพื่อวัดปริมาณที่แน่นอน นำเอามาผสมกับสารละลายชนิดอื่นที่ต้องการให้ได้ปริมาณและสัดส่วนที่พอเหมาะ ผสมให้เข้ากัน พยายามอย่าผสมแรงเพราะจะทำให้เกิดฟอง
      สารละลายที่ใช้จะต้องอุ่นให้ได้ 30 องศาเซลเซียส เป็นอย่างน้อยและไม่เกิน 35 องศาเซลเซียส เพื่อป้องกันไม่ให้อสุจิกระทบความเย็นทันที หลังจากผสมแล้วค่อยๆ ลดความเย็นลงโดยใช้เวลาไม่น้อยกว่า 1 ชม. จนถึง 5 องศาเซลเซียส แล้วจึงเก็บเข้าตู้เย็น

2. การเจือจางน้ำเชื้อ (semen dilution)  เมื่อรีดเก็บน้ำเชื้อมาได้ จะต้องรักษาอุณหภูมิของน้ำเชื้อให้อยู่ในสภาพอุ่นที่ 35 องศาเซลเซียส อยู่ตลอดเวลา จากสถานที่รีดเก็บน้ำเชื้อ มายังห้องปฏิบัติการ หลอดน้ำเชื้อจะถูกนำเข้าเก็บยังอ่างไฟฟ้า (water bath) อุณหภูมิ 35 องศาเซลเซียส ทันที สารปฏิชีวนะต่างๆ ได้แก่ penicillin, streptomycin และ polymyxin B จากนั้นทิ้งไว้ประมาณ 5 นาที แล้วจึงทำการเจือจางน้ำเชื้อให้เร็วที่สุด ทั้งนี้ก่อนทำการเจือจางน้ำเชื้อ จะต้องตรวจคุณภาพน้ำเชื้อก่อน โดยพิจารณาจาก
a. ปริมาตร (มิลลิลิตร)
b. อัตราการเคลื่อนไหว เป็นเส้นตรงเป็นเปอร์เซ็นต์ (progressive motility %)
c. ความหนาแน่นของเซลล์อสุจิ/มิลลิลิตร เพื่อคำนวณหาอัตราการเจือจางน้ำเชื้อด้วยสารละลายน้ำเชื้อที่เตรียมไว้ (35 องศาเซลเซียส)
       สมมติ ปริมาณน้ำเชื้อที่ดักเก็บไว้มีปริมาตร 5 มิลลิลิตร อัตราการเคลื่อนไหว 75% และความหนาแน่น 800 ล้านเซลล์/มิลลิลิตร
       ดังนั้นจะต้องทำการเจือจางน้ำเชื้อด้วยสารละลายน้ำเชื้อทั้งหมดจำนวน (ml)

= (% อัตราการเคลื่อนไหว x ปริมาณ (ml) x จำนวนความหนาแน่นล้านเซลล์ / ml )
                                   จำนวนอสุจิที่ต้องการ/ml

      สำหรับน้ำเชื้อเหลวจำนวนอสุจิที่ต้องการที่มีชีวิตอยู่ในขณะปฏิบัติการ 10 ล้านเซลล์ / ml ที่เป็นที่ยอมรับ
      สำหรับน้ำเชื้อแช่แข็งจำนวนอสุจิที่ต้องการอาจสูงถึง 30 ล้านเซลล์ / ml ทั้งนี้ต้องเผื่อการที่เซลล์อสุจิจะต้องเสียชีวิตลงในกระบวนแช่แข็งไว้ด้วย
      ดังนั้น สารละลายน้ำเชื้อทั้งหมด ml

( A + B ) =  0.75x5x800                     
                       10
             = 300 ml
       ถ้าจะทำการผลิตน้ำเชื้อเหลวให้มีเซลล์อสุจิที่ต้องการ 10 ล้านเซลล์ / ml จะต้องเติมสารละลายน้ำเชื้อจำนวน 300 – 5 = 295 ml
       ในกรณีที่จะเตรียมน้ำเชื้อแช่แข็ง
สารละลายน้ำเชื้อทั้งหมด ml

( A + B ) = 0.75x5x800                     
                      30
             = 100 ml
      ถ้าจะทำการผลิตน้ำเชื้อแช่แข็งให้มีเซลล์อสุจิที่ต้องการ 30 ล้านเซลล์ / ml จะต้องเติมสารละลายน้ำเชื้อจำนวน 100 – 5 = 95 ml
     ในกรณีที่จะทำการบรรจุน้ำเชื้อแช่แข็งใน French straw ขนาด 0.5 ml/dose จะทำให้ตัวหารต้องเปลี่ยนไปเป็น 60 ล้านเซลล์/ml
     ดังนั้นจะเป็นสารละลายน้ำเชื้อแช่แข็งทั้งหมด ml =
                                                  0.75x5x800                                                                  
                                                        60
                                                = 50 ml
     เมื่อนำมาบรรจุใน straw ขนาด 0.5 ml จะได้จำนวน 100 straw (100 doses)
     สำหรับการผลิตน้ำเชื้อแช่แข็ง สารละลายน้ำเชื้อแช่แข็งทั้งหมด ประกอบด้วยส่วน A และ B ในปริมาตรที่เท่ากัน ส่วน A คือ ส่วนที่ไม่มี glycerol มีอุณหภูมิ 35 องศาเซลเซียส น้ำเชื้อที่รีดดักเก็บได้จะถูกผสมลงในส่วน A ในกรณีนี้จะเป็นสารละลายน้ำเชื้อส่วน A จะมีเพียง 25 ml เท่านั้น ไข่แดงที่มีส่วนผสมของ lecithin และ lipoprotein จะป้องกันเซลล์อสุจิจากการเปลี่ยนแปลงของอุณหภูมิ (cold shock) น้ำเชื้อที่เจือจางจะถูกทำให้เย็นลงจนถึงอุณหภูมิ 5 องศาเซลเซียส อย่างน้อยต้องกินเวลาประมาณ 2 ชม. เพื่อให้สารปฏิชีวนะออกฤทธิ์กับจุลชีพ ที่อาจมีติดมากับน้ำเชื้อก่อนส่วน B (ส่วนที่มี glycerol) จะถูกเติมลงในส่วน A mละหยดในตู้เย็น

3. การลดอุณหภูมิลงของน้ำเชื้อหลังจากเจือจาง (cooling semen)   เป็นสิ่งที่ต้องกระทำด้วยความระมัดระวัง เนื่องจาก น้ำเชื้อภายหลังการเจือจางจะมีอุณหภูมิประมาณ 30 องศาเซลเซียส การลดอุณหภูมิลงไปที่ 5 องศาเซลเซียส อย่างกะทันหันจะทำให้เกิด cold shock การค่อยๆ ลดอุณหภูมิลงไปที่ 5 องศาเซลเซียส มีความจำเป็นต่อการมีชีวิตรอดและอัตราการผสมติดของอสุจิ โดยทั่วไปแล้วในโคการลดอุณหภูมิจาก 30 องศาเซลเซียสไปที่ 5 องศาเซลเซียส จะใช้เวลาประมาณ 2 ชม. เป็นอย่างน้อย
       การลดอุณหภูมิของน้ำเชื้อทำได้โดยการใส่หลอดน้ำเชื้อที่ทำการเจือจางแล้วอุณหภูมิ 35 องศาเซลเซียส ลงในบีกเกอร์ขนาดใหญ่ที่บรรจุน้ำเย็นที่อุณหภูมิห้อง 20-28 องศาเซลเซียส แล้วนำไปใส่ตู้เย็นที่ตั้งอุณหภูมิไว้ที่ 5 องศาเซลเซียส ระยะเวลาเร็วหรือช้าจะถูกปรับได้ด้วยปริมาณน้ำหล่อเย็นในบีกเกอร์ ถ้าปริมาณน้ำมีมาก การลดอุณหภูมิของน้ำเชื้อจะใช้เวลานานขึ้นกว่าปริมาณน้ำหล่อเย็นที่มีน้อยกว่า
4. การเติมกลีเซอรอล และการปรับสภาพน้ำเชื้อ (glycerolation and equilibration)   เป็นตัวป้องกันเซลล์อสุจิจากความเสียหายในสภาพแช่แข็ง เมื่อเติมกลีเซอรอลลงไป กลีเซอรอลจะซึมผ่านผนังเซลล์อสุจิทำให้น้ำที่มีอยู่ถูกขับออกจากเซลล์ไปบางส่วน และทำให้อุณหภูมิที่สามารถทำให้เกิดสภาพแช่แข็งภายในเซลล์ลดต่ำลง สภาพความหนาแน่นของสารละลายภายในเซลล์ก็ลดต่ำลงด้วย นอกจากนี้กลีเซอรอลที่อยู่ภายนอกเซลล์จะจับตัวเข้ากับน้ำ ทำให้อุณหภูมิที่ทำให้เกิดสภาพแช่แข็งของสารละลายภายนอกเซลล์ต่ำลงด้วย ดังนั้นผลึกน้ำแข็งขนาดใหญ่ที่อาจเกิดขึ้นในสภาพที่ไม่มีกลีเซอรอล และทำความเสียหายให้แก่เซลล์อสุจิจึงเกิดขึ้นไม่ได้ เมื่อมีการเติมกลีเซอรอล การเกิดน้ำแข็งจากสภาพแช่แข็งที่เกิดขึ้นในทุกอุณหภูมิที่เปลี่ยนแปลงไปจะน้อยกว่าสภาพที่ไม่มีกลีเซอรอล ทั้งภายนอกและภายในเซลล์ เมื่อแช่แข็งเซลล์เมื่อมีปริมาณกลีเซอรอลภายในและภายนอกเซลล์อสุจิที่เหมาะสมจึงไม่เกิดอันตรายต่อเซลล์อสุจิ
      ในการเติมกลีเซอรอลลงในสารเจือจางน้ำเชื้อเพื่อให้เกิดความสมดุลของสภาพกลีเซอรอลที่เหมาะสมทั้งภายในและภายนอกเซลล์ต้องมีเทคนิค ดังนี้
      สารเจือจางน้ำเชื้อ จะถูกแบ่งออกเป็นสองส่วนเท่าๆ กัน ก่อนนำมาเจือจางน้ำเชื้อ คือ ส่วน A และ ส่วน B
     - ส่วน A เป็นส่วนที่ไม่มีกลีเซอรอลเป็นองค์ประกอบ ใช้เจือจางน้ำเชื้อทันทีหลังตรวจคุณภาพ
     - ส่วน B เป็นส่วนทีมีกลีเซอรอลเป็นองค์ประกอบใช้เติมกลีเซอรอลลงไปในส่วน A ทีหลังดังนี้
      สารละลาย A จะถูกทำให้อุ่นขึ้นที่ 30 องศาเซลเซียส ส่วนสาร B เก็บไว้ในตู้เย็นที่ 5 องศาเซลเซียส ผสมน้ำเชื้อที่รีดได้ลงไปทั้งหมดในสาร A และค่อยๆ ทำให้เย็นลง โดยตั้งให้เย็นในห้อง อาจแช่น้ำเย็น 20 องศาเซลเซียส แล้วลดอุณหภูมิลงเรื่อยๆ ใช้เวลาประมาณ 1 ชม. จึงนำเข้าตู้เย็น เพื่อทำให้เย็นลงที่ 5 องศาเซลเซียส ใช้เวลาอีกประมาณ 1 ชม. จากนั้นค่อยหยดสารละลาย B ลงในเชื้อเหลว A ทีละหยดจนหมด (ประมาณ 2 ชม.)
      การเตรียมกลีเซอรอล ในสูตรไข่แดงซีเตรท หรือน้ำนม ควรเติมที่อุณหภูมิ 5 องศาเซลเซียส เพราะหากเติมสูงกว่าอุณหภูมินี้ทำให้การมีชีวิตและการเคลื่อนไหวลดลง ทั้งนี้เพราะเกิดการสูญเสียเอนไซม์ glutamic-oxalacetic transaminase ส่วนสูตรไข่แดงทรีส เติมได้ที่อุณหภูมิ 35 องศาเซลเซียส หรือถ้าไม่ใช้วิธีข้างต้นในการเติมที่ 5 องศาเซลเซียส กรณีสูตรไข่แดงซิเตรทหรือน้ำนมควรเติม 4 ครั้ง โดยแบ่งสารเจือจางน้ำเชื้อส่วน B ออกเป็น 4 ส่วน และเติม 4 ครั้ง ห่างกันครั้งละ 15 นาที ก็ได้
       การปรับสภาพของน้ำเชื้อก่อนนำไปแช่แข็ง (equilibration time) ก่อนนำน้ำเชื้อไปแช่แข็งจะต้องมีการรอให้น้ำเชื้อที่ถูกเจือจางแล้วที่มีกลีเซอรอลเป็นองค์ประกอบทั้งสองส่วน A และ B เข้ากันเป็นเนื้อเดียวกัน และต้องรอให้กลีเซอรอลซึมผ่านเข้าผนังเซลล์อสุจิได้อย่างเหมาะสม คือปริมาณกลีเซอรอลที่อยู่ภายในเซลล์มีภาวะสมดุลกับกลีเซอรอลที่อยู่ภายนอกเซลล์ ซึ่งขึ้นอยู่กับสูตรของสารละลายน้ำเชื้อที่เตรียมขึ้น ซึ่งจะกินเวลานานประมาณ 4 ชม. และระยะเวลาการปรับสภาพน้ำเชื้อโดยทั่วไปของโคอยู่ระหว่าง 8-12 ชม. ซึ่งช่วงเวลานี้จะเป็นระยะเวลาการปรับสภาพของน้ำเชื้อก่อนนำไปแช่แข็ง น้ำเชื้อที่ถูกเจือจางแล้วและมีกลีเซอรอลเป็นองค์ประกอบจะถูกเก็บรักษาไว้ในตู้เย็นที่อุณหภูมิ 5 องศาเซลเซียส เพื่อรอการดำเนินการขั้นต่อไป
5. การบรรจุน้ำเชื้อลงในภาชนะบรรจุน้ำเชื้อ (semen packaging ampules and straw)   เมื่อปรับสภาพน้ำเชื้อแล้ว ให้ทำการตรวจหาเปอร์เซ็นต์การเคลื่อนไหวของอสุจิอีกครั้งก่อนทำการบรรจุน้ำเชื้อลงในหลอดบรรจุน้ำเชื้อ เซลล์อสุจิควรมีการเคลื่อนไหวดีเช่นเดียวกับที่เริ่มเจือจางใหม่ๆ จากนั้นทำการบรรจุน้ำเชื้อเข้าสู่หลอดบรรจุ และทำการบรรจุ จะต้องทำการในอุณหภูมิ 5 องศาเซลเซียสตลอดเวลา หลอดสำหรับบรรจุน้ำเชื้อ เรียกว่า หลอดฟางบรรจุน้ำเชื้อ ซึ่งในปัจจุบันมี 3 ขนาด ได้แก่ 0.25, 0.3 และ 0.5 มิลลิลิตร โดยหลอดฟางสำหรับบรรจุน้ำเชื้อนี้มีส่วนประกอบ 3 ส่วน คือ ปลายสุดเป็นก้อนสำลี มีผง poly vinyl อยู่ตรงกลาง และก้อนสำลีกันอยู่อีกขั้นหนึ่ง โดยหลอดฟางบรรจุน้ำเชื้อจะมีสีต่างๆ เพื่อให้สะดวกต่อการจำแนกพันธุ์ และยังสามารถพิมพ์ข้อความที่เกี่ยวกับข้อมูล เช่น เบอร์โค วันที่ผลิตน้ำเชื้อ ลงไปได้ ทำให้สะดวกต่อการใช้งานมาก
       การบรรจุเข้าหลอดน้ำเชื้อแบบหลอดฟางพลาสติก (straw) จะมีการบรรจุโดยใช้เครื่องบรรจุน้ำเชื้อที่ต่อกับเครื่องดูด (suction pump) หรือเข็มเบอร์ 16 ปลายตัดที่ต่อกับกระบอกฉีดยา ต่อเข้ากับปลายส่วนนี้ ดูดน้ำเชื้อเข้าสู่หลอดตรงปลายอีกด้านหนึ่งให้เหลือปลายด้านล่างว่างไว้ประมาณ 1/2 ซม. จากนั้นกดปลายด้านล่างของหลอดน้ำเชื้อส่วนที่ปล่อยว่างไว้บนผงอุด (sealing powder) หรือ ผงไวนิลแอลกอฮอล์ (polyvinyl alcohol powder) แล้วจุ่มปลายหลอดส่วนที่มีผลอุดอยู่ในน้ำเย็น 5 องศาเซลเซียส เพื่อให้ผงอุดแข็งตัว (30 นาที) และใช้ผ้าเช็ดหลอดให้แห้ง ผงไวนิลแอลกอฮอล์จะไม่แข็งตัว และยอมให้อากาศผ่านถ้ายังเป็นผงแห้งอยู่ เมื่อสัมผัสน้ำหรือสารละลายน้ำเชื้อผงจะแปรสภาพแข็งตัวไม่ยอมให้สิ่งใดๆ แม้แต่อากาศผ่านเข้าไปได้เลย
6. การแช่แข็งน้ำเชื้อ (freezing technique)    Luyet และ Gehenio ได้ตั้งทฤษฎีว่าการแช่แข็งน้ำเชื้อ เพื่อทำให้เซลล์อสุจิรอดชีวิตและใช้สืบพันธุ์ได้ สามารถทำได้ถ้าสามารถป้องกันการเกิดเกล็ดน้ำแข็งภายในเซลล์ลง โดยการลดจำนวนน้ำที่อยู่ภายในเซลล์ลงก่อนที่จะแช่แข็ง และควรทำการแช่แข็งด้วยความรวดเร็ว (rapid cooling and freezing) ซึ่งทฤษฎีดังกล่าวอธิบายว่า
      a. การเปลี่ยนแปลงของเซลล์อสุจิขณะแช่แข็งและทำการละลาย โดยทั่วไปแล้วอุณหภูมิวิกฤตสำหรับเซลล์ระหว่างการแช่แข็ง คือ อุณหภูมิระหว่าง -15 ถึง -60 องศาเซลเซียส อสุจิจะพบอุณหภูมิวิกฤต 2 ครั้ง ครั้งแรกเกิดขึ้นในขณะแช่แข็ง ครั้งที่สองเกิดขึ้นขณะทำละลาย ขณะแช่แข็งที่ -196 องศาเซลเซียส สภาวะต่างๆ ที่เกี่ยวข้องกับการเปลี่ยนแปลงของอุณหภูมิไม่มีเนื่องจากหากอุณหภูมิต่ำกว่า -130 องศาเซลเซียส แล้ว สภาพน้ำเชื้อภายในเซลล์จะเป็นผลึกที่คงตัว
      b. การเปลี่ยนแปลงของน้ำภายในเซลล์ขณะทำการแช่แข็ง ขณะลดอุณหภูมิไปประมาณ -5 องศาเซลเซียส สภาวะของน้ำภายในเซลล์ และสารละลายที่อยู่แวดล้อมจะยังไม่เป็นน้ำแข็ง เนื่องจากผลของ supercooling หรือ สภาวะการเป็นสารละลายของน้ำยาเจือจางที่มีสารป้องกันระหว่างอุณหภูมิ -5 องศาเซลเซียส และ -15 องศาเซลเซียส จะมีการก่อตัวของน้ำแข็งภายนอกเซลล์ทั้งที่เกิดเองและเมื่อมีการทำ seeding ซึ่งน้ำภายนอกเซลล์จะกลายเป็นน้ำแข็งแต่น้ำภายในเซลล์จะยังไม่เป็นน้ำแข็ง
       สภาวะภายในเซลล์ในลำดับต่อไปขึ้นกับอัตราของการลดอุณหภูมิ โดยหากมีการลดอุณหภูมิอย่างช้าจนได้ระดับ น้ำจะสามารถออกไปจากเซลล์ได้อย่างรวดเร็ว เนื่องจากความเข้มข้นของสารภายในเซลล์สูงกว่าภายนอกเซลล์ จึงเกิด exosmosis ทำให้เซลล์ปรับสภาพเพื่อให้เกิดความสมดุล ผลคือ เซลล์จะเหี่ยวและภายในไม่แข็งตัว เมื่อภายหลังจากแช่แข็งแล้ว หลังทำให้เซลล์อุ่นขึ้นจากการทำละลายน้ำเชื้อ (thawing) เซลล์เหล่านี้มักจะเสียหายและตายไป ในทางตรงกันข้าม หากการลดอุณหภูมิเป็นไปอย่างรวดเร็วมาก (rapid freezing) การสูญเสียน้ำออกนอกเซลล์เกิดได้ไม่ทัน เกิดความสมดุลของสารละลายทั้งภายในและภายนอกเซลล์ เซลล์จะเป็นปกติ เมื่อภายหลังจากการแช่แข็งแล้ว
      หากเซลล์ถูกลดอุณหภูมิลงเร็วปานกลาง การสูญเสียน้ำเกิดขึ้นไปได้มาก แต่ยังคงเหลือ เกิดความสมดุลสารละลายโดยที่ยังมีน้ำภายในเซลล์ไม่มากนัก การแช่แข็งของเซลล์อสุจิจึงอาจทำได้โดยไม่ก่อให้เกิดความเสียหายแก่เซลล์อสุจิ
      การทำให้น้ำเชื้อแข็งตัว (freezing) สามารถทำได้ 2 วิธี คือ ใช้อ่างแอลกอฮอล์ (alcohol bath) หรือไอของไนโตรเจนเหลว การใช้อ่างแอลกอฮอล์จะเป็นการลดอุณหภูมิอย่างช้าๆ ใช้น้ำแข็งแห้ง (dry-ice) เป็นตัวลดความเย็น นำหลอดน้ำเชื้อที่บรรจุแล้วแช่ลงในอ่างแอลกอฮอล์ ที่มีอุณหภูมิ 5 องศาเซลเซียส ค่อยๆ หย่อน dry-ice ลงใน alcohol bath เพื่อควบคุมอุณหภูมิให้ลดลงตามความต้องการ คือ
จาก +5 องศาเซลเซียส ถึง -5 องศาเซลเซียส อัตราลด 1 องศาเซลเซียส /นาที
จาก -5 องศาเซลเซียส ถึง -75 องศาเซลเซียส อัตราลด 7 องศาเซลเซียส / นาที
จาก -75 องศาเซลเซียส ถึง -79 องศาเซลเซียส ลดได้ทันที
จาก -79 องศาเซลเซียส ถึง -196 องศาเซลเซียส ลดได้ทันที
     อ่างแอลกอฮอล์นี้จะต้องมีเครื่องกวน คอยคนอยู่ตลอดเวลา และมีเครื่องวัดอุณหภูมิ เพื่อจะได้ควบคุมอัตราการลดอุณหภูมิได้ตามต้องการ
     สำหรับการทำน้ำเชื้อแข็งตัวโดยใช้ไอของไนโตรเจนเหลว ในปัจจุบันมีเครื่องลดอุณหภูมิอัตโนมัติควบคุมโดยคอมพิวเตอร์ โดยใช้ไอของไนโตรเจนเหลวเป็นตัวลดอุณหภูมิ อุณหภูมิที่ลดลงต้องไม่ต่ำกว่า 7 องศาเซลเซียส / นาที จนถึง -126 องศาเซลเซียส / นาที ในการแช่แข็งทั่วไปไม่ใช้เครื่องควบคุม ให้ทำการเรียงหลอดน้ำเชื้อในแนวนอนบนตะแกรง (ทำในตู้เย็น อุณหภูมิ 5 องศาเซลเซียส) จากนั้นนำตะแกรงดังกล่าวไปวางบนไอของไนโตรเจนเหลว โดยให้ตะแกรงอยู่เหนือระดับของไนโตรเจนเหลว ประมาณ 2 นิ้ว หรือประมาณ 5.5 ซม. อุณหภูมิของน้ำเชื้อในหลอดฟางพลาสติกจะลดลงเท่ากับไอของไนโตรเจนเหลว คือ ประมาณ -120 องศาเซลเซียส น้ำเชื้อก็จะแข็งตัวภายใน 2 นาที วางไว้เช่นนี้นาน 20 นาที จากนั้นก็ย้ายหลอดน้ำเชื้อลงเก็บในถังเก็บน้ำเชื้อทันทีในสภาวะไนโตรเจนเหลวอุณหภูมิ -196 องศาเซลเซียส
การเก็บรักษาน้ำเชื้อ (Storage and handling of liquid and frozen semen)   การเก็บรักษาน้ำเชื้อเหลวเก็บไว้ในตู้เย็น อุณหภูมิ 5 องศาเซลเซียส ได้นานประมาณ 3-5 วัน และควรปิดภาชนะให้สนิท ไม่ให้น้ำและฝุ่นละอองลงเปรอะเปื้อนปนลงในน้ำเชื้อ และควรตรวจคุณภาพโดยการตรวจอัตราการเคลื่อนไหวทุกครั้ง ก่อนนำไปใช้งาน
      การเก็บน้ำเชื้อแช่แข็ง จะถูกเก็บในถังไนโตรเจนเหลวอุณหภูมิ -196 องศาเซลเซียส ซึ่งภายในจะเป็นที่บรรจุไนโตรเจนเหลว และกระบอกเก็บน้ำเชื้อ (canister) ควรตรวจวัดระดับไนโตรเจนเหลวในถังทุกสัปดาห์ โดยเปิดฝาถัง และหย่อนไม้บรรทัดที่ทำด้วยไม้ชนิดทนความเย็นลงไปจนถึงก้นถัง ปล่อยทิ้งไว้ 8-10 วินาที แล้วดึงไม้บรรทัดขึ้นมาแกว่งในอากาศ จะเกิดหมอกสีขาวจับที่ไม้บรรทัด ตามความลึกของระดับไนโตรเจนเหลว ปากกระบอกเก็บน้ำเชื้อ เมื่อถูกดึงขึ้นเพื่อตรวจหาหลอดน้ำเชื้อจะต้องอยู่ต่ำกว่าขอบของคอถัง 3-5 ซม. เสมอ

                           รูปภาพที่ 2 แสดงการเก็บรักษาน้ำเชื้อแช่แข็งในไนโตรเจนเหลว
      ในการดึงหลอดน้ำเชื้อขึ้นมาเลยบริเวณที่มองเห็นเป็นขอบน้ำแข็งของคอถัง จะเสี่ยงต่อความเสียหายของตัวอสุจิ มักเกิดขึ้นเสมอ เมื่อมีการเปลี่ยนถังที่เก็บน้ำเชื้อ เนื่องจาก น้ำที่อยู่ภายในเซลล์จะมีรูปร่างไม่คงที่ หากอุณหภูมิสูงกว่า -80 องศาเซลเซียส ซึ่งอุณหภูมิที่ปลอดภัยของน้ำเชื้อ คือ ต่ำกว่า -117 องศาเซลเซียส ดังนั้นการเคลื่อนย้ายหรือขยับหลอดน้ำเชื้อ จะต้องทำด้วยความระมัดระวัง และรวดเร็ว แม้ว่าอุณหภูมิภายในถังไนโตรเจนเหลวขณะที่ปิดไว้จะต่ำมาก แต่เมื่อเปิดฝาอุณหภูมิจะแปรปรวน ดังนั้น เพื่อความปลอดภัยจึงควรมีไนโตรเจนเหลวท่วมหลอดอยู่เสมอ

                           วิดีโอที่ 1 การแช่แข็งน้ำเชื้อและการเก็บรักษา (ที่มา: กบนอกกะลา)

การหยิบจับหลอดน้ำเชื้อเพื่อการผสมเทียมและการละลายน้ำเชื้อแช่แข็ง   
      การหยิบจับหลอดน้ำเชื้อไปใช้ไม่ดี เป็นสาเหตุหนึ่งที่ทำให้น้ำเชื้อเสื่อมคุณภาพ มักพบเมื่อมีการถ่ายหลอดน้ำเชื้อจากถังใหญ่ไปสู่ถังสนาม และการละลายน้ำเชื้อเพื่อการผสมเทียมไม่ถูกต้อง
     การถ่ายหลอดน้ำเชื้อจากถังใหญ่ไปสู่ถังสนาม เพื่อนำไปทำการผสมเทียมในพื้นที่ ต้องมีการวางแผนที่ดี ไม่ออกมาใส่ถังสนามมากเกินไป ควรหยิบเพื่อนำไปใช้เท่าที่จำเป็น เนื่องจากการหยิบหลอดน้ำเชื้อขึ้นมาพ้นจากระดับไนโตรเจนเหลวหลายครั้ง ทำให้น้ำเชื้อแช่แข็งมีการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิ น้ำเชื้อจึงเสื่อมคุณภาพลง น้ำเชื้อในถังสนามที่เหลือจากการออกไปปฏิบัติงานประจำวัน ไม่ควรนำกลับคืนลงถังเก็บใหญ่ เพราะเป็นสาเหตุที่ทำให้ผสมไม่ติด
     การหยิบจับหลอดน้ำเชื้อแช่แข็งควรใช้ปากคีบหยิบ ห้ามใช้มือ เนื่องจากความร้อนจากมือ จะทำให้อุณหภูมิน้ำเชื้อแช่แข็งเปลี่ยนแปลง การถ่ายน้ำเชื้อจากถังใหญ่ลงในถังสนาม ควรกระทำอย่างรวดเร็ว ไม่ควรใช้เวลานานเกิน 3 วินาที เพื่อให้มีการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิน้อยที่สุดเท่าที่จะทำได้ ดังนั้นควรนำน้ำเชื้อแช่แข็งออกไปปฏิบัติงานในจำนวนที่พอเหมาะตามการใช้งาน และควรแยกน้ำเชื้อเก่าและใหม่ให้ชัดเจน ไม่ควรนำมาปะปนกัน
การละลายน้ำเชื้อเพื่อการผสมเทียม   
       การละลายน้ำเชื้อแช่แข็งที่ถูกต้อง ต้องรีบละลายในน้ำอุ่นอุณหภูมิ 35-37 องศาเซลเซียส ทันทีที่ใช้ปากคีบหยิบหลอดน้ำเชื้อออกมาจากถังสนาม การละลายใช้เวลา 30 วินาที ไม่ควรนำน้ำเชื้อแช่แข็งออกมาสัมผัสอากาศนานเกิน 3 วินาที ห้ามทำการละลายน้ำเชื้อโดยวิธีการโบกไปมาในอากาศ ใช้อุ้งมือปั่นหลอดน้ำเชื้อไปมา ซุกไว้ใต้แขน ใช้เสื้อผ้าหรือกระดาษทิชชูเช็ดหลอดน้ำเชื้อแทนการละลาย หรือละลายน้ำเชื้อแช่แข็งในน้ำเย็นธรรมดา เพราะจะทำให้น้ำเชื้อเสื่อมคุณภาพ เนื่องจากการกระทำดังกล่าวทำให้น้ำเชื้อแช่แข็งละลายอย่างช้าๆ เป็นสาเหตุให้เกิดเกล็ดน้ำแข็งทำลายตัวอสุจิ จึงต้องรีบละลายในน้ำอุ่นทันที เพื่อป้องกันการเกิดเกล็ดน้ำแข็งหลังจากละลาย 30 วินาทีแล้ว ต้องเช็ดหลอดน้ำเชื้อให้แห้งก่อนนำมาใส่ปืนฉีดน้ำเชื้อ เพื่อนำไปผสมเทียม ระยะเวลาจากการละลายน้ำเชื้อแช่แข็งจนถึงการฉีดเชื้อไม่ควรเกิน 15 นาที น้ำเชื้อที่ผ่านการละลายแล้ว หากไม่ได้ใช้งาน ห้ามนำกลับคืนลงถังอีก เพราะน้ำเชื้อจะเสื่อมคุณภาพ

การอ่านรหัสบนหลอดน้ำเชื้อ   ในการผลิตน้ำเชื้อ ต้องมีการพิมพ์รหัสลงบนหลอดที่จะใช้บรรจุน้ำเชื้อ โดยระบุชื่อพ่อพันธุ์ หมายเลขหรือรหัสพ่อพันธุ์ สายเลือดพันธุ์ วันที่ผลิต สถานที่ผลิต เครื่องพิมพ์หลอดน้ำเชื้อมีหลายชนิด

อ้างอิง

การผสมเทียม. 2554. http://www.dld.go.th/airc_urt/th/
กองผสมเทียม กรมปศุสัตว์ คู่มือฝึกอบรมการผสมเทียมโค. โรงพิมพ์ชุมนุมสหกรณ์การเกษตรแห่ง

ประเทศไทย กทม. 190 หน้า

พรรณพิไล เสกสิทธิ์. 2548. เทคโนโลยีการผสมเทียมและปัญหาการสืบพันธุ์ปศุสัตว์. สำนัก

เทคโนโลยีชีวภาพการผลิตปศุสัตว์ กรมปศุสัตว์ กระทรวงเกษตรและสหกรณ์.

สัตวแพทยสภา. 2548. การผสมเทียมโค. กรมปศุสัตว์. การฝึกอบรมการผสมเทียมโคภายใต้

โครงการสงเสริมการเลี้ยงโคเนื้อล้านครอบครัว.